Hydrofilní interakční chromatografie - Hydrophilic interaction chromatography

Hydrofilní interakční chromatografie (nebo hydrofilní interakční kapalinová chromatografie, HILIC) je varianta kapalinová chromatografie s normální fází že se částečně překrývá s jinými chromatografickými aplikacemi, jako je iontová chromatografie a kapalinová chromatografie na reverzní fázi. HILIC používá hydrofilní stacionární fáze s reverzní fází eluenty. Jméno navrhl Dr. Andrew Alpert ve své práci na toto téma z roku 1990.[1] Popsal pro ni chromatografický mechanismus jako kapalina-kapalina rozdělovací chromatografie kde se analyty eluují v pořadí se zvyšující se polaritou, závěr podporovaný kontrolou a přehodnocením publikovaných dat.[2]

Technika dělení HILIC Užitečný rozsah

Povrch

Žádný polární pro separaci HILIC lze použít chromatografický povrch. Dokonce i nepolární pojené kyseliny křemičité byly použity s extrémně vysokým složením organického rozpouštědla, když byl oxid křemičitý použitý pro chromatografická média obzvláště polární. S touto výjimkou lze HILIC fáze rozdělit do pěti kategorií neutrálních polárních nebo iontových povrchů:

Mobilní fáze

Typický Mobilní fáze pro HILIC chromatografie zahrnuje acetonitril („MeCN“, také označovaný jako „ACN“) s malým množstvím vody. Jakékoli aprotické rozpouštědlo mísitelné s vodou (např. THF nebo dioxan ) může být použito. Lze také použít alkoholy, avšak jejich koncentrace musí být vyšší, aby se dosáhlo stejného stupně retence alkoholu analyt vzhledem k aprotické kombinaci rozpouštědlo - voda. Viz také Vodná chromatografie s normální fází

Obecně se věří, že v HILIC, Mobilní fáze tvoří na povrchu polární vrstvu bohatou na vodu stacionární fáze vs. nedostatek vody Mobilní fáze, vytvoření systému extrakce kapalina / kapalina. The analyt je rozdělen mezi tyto dvě vrstvy. HILIC však není jen jednoduché dělení a zahrnuje interakce donoru vodíku mezi neutrálními polárními druhy a slabé elektrostatické mechanismy za podmínek vysokého retence organických rozpouštědel. To odlišuje HILIC jako mechanismus odlišný od iontoměničová chromatografie. Více polární sloučeniny bude mít silnější interakci se stacionárním vodný vrstva méně polární sloučeniny. Dochází tedy k separaci na základě polarity sloučeniny a stupně solvatace.

Přísady

Iontový přísady, jako např octan amonný a mravenčan amonný se obvykle používají k regulaci Mobilní fáze pH a iontová síla. V HILIC mohou také přispívat k polaritě analytu, což vede k rozdílným změnám v retenci. Pro extrémně polární analyty (např. Aminoglykosidová antibiotika (gentamicin ) nebo Adenosintrifosfát ), aby se zajistilo, že analyt bude v jediné iontové formě, jsou nutné vyšší koncentrace pufru (přibližně 100 mM). Jinak bude pozorován asymetrický tvar píku, chromatografická stopa a / nebo špatné zotavení ze stacionární fáze. Pro separaci neutrálních polárních analytů (např. Sacharidů) není nutný žádný pufr.

Použití jiných solí, jako je 100-300 mM chloristan sodný, které jsou rozpustné ve směsích vysoce organických rozpouštědel (asi 70% - 90% acetonitril ), lze použít ke zvýšení polarity mobilní fáze pro ovlivnění eluce. Tyto soli nejsou těkavé, takže tato metoda je méně užitečná s hmotnostním spektrometrem jako detektorem. Obvykle postačuje gradient (ke zvyšujícímu se množství vody) k podpoře eluce.

Všechny ionty se do určité míry rozdělí do stacionární fáze, takže je nutné občasné „promytí“ vodou, aby byla zajištěna reprodukovatelná stacionární fáze.

Aplikace

K oddělení některých se používá značně separační režim HILIC biomolekuly, organický a nějaký anorganické molekuly[4] rozdíly v polaritě. Jeho užitečnost se zvýšila díky zjednodušené přípravě vzorků pro biologické vzorky při analýze na metabolity, protože metabolický proces obecně vede k přidání polárních skupin ke zvýšení eliminace z buněčné tkáně. Tato separační technika je také zvláště vhodná pro glykosylace analýza[5] a zajištění kvality glykoproteiny a glykoformy v biologické lékařské výrobky.[6] Pro detekci polárních sloučenin s použitím elektrosprejové ionizační hmotnostní spektrometrie jako chromatografického detektoru může HILIC nabídnout desetinásobné zvýšení citlivosti oproti chromatografie na reverzní fázi[4] protože organické rozpouštědlo je mnohem těkavější.

Volba pH

U povrchově chemických látek, které jsou slabě iontové, může volba pH ovlivnit iontovou povahu chemie kolony. Správně upravené pH lze nastavit tak, aby se snížila selektivita vůči funkčním skupinám se stejným nábojem jako kolona, ​​nebo se zvýšila pro opačně nabité funkční skupiny. Podobně volba pH ovlivňuje polaritu rozpuštěných látek. Avšak u chemických látek na povrchu kolony, které jsou silně iontové, a proto odolné vůči hodnotám pH ve středním rozsahu stupnice pH (pH 3,5–8,5), budou tyto separace odrážet polaritu samotných analytů, a proto mohou být snazší pochopení při vývoji metod.

ERLIC

V roce 2008 vytvořil Alpert termín ERLIC[7] (elektrostatická odpuzovací hydrofilní interakční chromatografie), pro separace HILIC, kde se k odpuzování běžné iontové polární skupiny na analytu nebo v sadě analytů používá iontová povrchová chemie kolony, aby se usnadnila separace zbývajícími polárními skupinami. Elektrostatické účinky jsou řádově silnější chemický potenciál než neutrální polární efekty. To umožňuje minimalizovat vliv běžné iontové skupiny v sadě molekul analytu; nebo snížit stupeň retence z těchto více polárních funkčních skupin, v některých situacích dokonce umožnit izokratické separace místo přechodu. Jeho následná publikace dále popsala orientační efekty[8] které ostatní nazývají také iontový pár normální fáze[9] nebo e-HILIC, odrážející retenční mechanismy citlivé na konkrétní iontovou část analytu, ať už atraktivní nebo odpudivé. ERLIC (eHILIC) separace nemusí být izokratické, ale čistým efektem je snížení přitažlivosti zvláště silné polární skupiny, která pak vyžaduje méně silné eluční podmínky, a lepší interakce zbývající polární (opačně nabité iontové nebo ne -iontové) funkční skupiny analytu (analytů).

Kationický eHILIC

Například by se dalo použít kationtoměničovou (záporně nabitou) povrchovou chemii pro separace ERLIC, aby se snížil vliv na retenci aniontových (záporně nabitých) skupin (fosfáty nukleotidů nebo fosfonylové antibiotické směsi; nebo skupiny kyseliny sialové z modifikovaných sacharidů) nyní umožnit separaci založenou spíše na základních a / nebo neutrálních funkčních skupinách těchto molekul. Modifikace polarity slabě iontové skupiny (např. Karboxylové) na povrchu se snadno provádí úpravou pH tak, aby bylo v rozmezí dvou jednotek pH pKa této skupiny. U silně iontových funkčních skupin povrchu (tj. Síranů nebo fosforečnanů) lze místo toho použít nižší množství pufru, takže zbytkový náboj není zcela iontově spárován. Příkladem toho by bylo použití mobilní fáze 12,5 mM (spíše než doporučeného pufru> 20 mM), pH 9,2 polymerní, zwitterionický, betain -sulfonát povrch k oddělení fosfonyl-antibiotických směsí (každá obsahuje fosfátovou skupinu). To zvyšuje vliv sloupce kyselina sulfonová funkční skupiny jeho povrchové chemie nad jeho, mírně sníženým (o pH), kvartérním aminem. V souladu s tím budou tyto analyty vykazovat sníženou retenci na koloně eluováním dříve a ve vyšších množstvích organického rozpouštědla, než kdyby byl použit neutrální polární povrch HILIC. To také zvyšuje jejich citlivost detekce hmotnostní spektrometrií záporných iontů.

Aniontový eHILIC

Analogicky k výše uvedenému lze použít chemii povrchu kolony s aniontovou výměnou (kladně nabitou) ke snížení vlivu na retenci kationtových (kladně nabitých) funkčních skupin pro sadu analytů, například při selektivní izolaci fosforylovaných peptidů nebo molekul sulfátovaného polysacharidu. . Použití pH mezi 1 a 2 jednotkami pH sníží polaritu dvou ze tří ionizovatelných kyslíků fosfátové skupiny a umožní tak snadnou desorpci z (opačně nabité) povrchové chemie. Rovněž sníží vliv negativně nabitých karboxylů v analytech, protože budou protonovány při této nízké hodnotě pH, a tím přispějí k menší celkové polaritě molekuly. Jakékoli běžné, pozitivně nabité aminoskupiny budou odpuzovány z chemie povrchu kolony, a tak tyto podmínky zvyšují roli polarity fosfátu (stejně jako dalších neutrálních polárních skupin) v separaci.

Reference

  1. ^ Alpert, Andrew J. (1990). „Hydrofilní interakční chromatografie pro separaci peptidů, nukleových kyselin a jiných polárních sloučenin“. Journal of Chromatography. 499: 177–196. doi:10.1016 / S0021-9673 (00) 96972-3. PMID  2324207.
  2. ^ Petrus Hemström a Knut Irgum (2006). "Recenze: Hydrofilní interakční chromatografie". J. Sep. Sci. 29 (12): 1784–1821. doi:10.1002 / jssc.200600199. PMID  16970185.
  3. ^ Boguslaw Buszewski a Sylwia Noga (2012). „Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie (HILIC) - účinná separační technika“. Anální. Bioanal. Chem. 402 (1): 231–247. doi:10.1007 / s00216-011-5308-5. PMC  3249561. PMID  21879300.
  4. ^ A b Eric S. Grumbach; et al. (Říjen 2004). „Hydrofilní interakční chromatografie využívající kolony oxidu křemičitého pro retenci polárních analytů a zvýšenou citlivost ESI-MS“. LCGC Magazine. Archivovány od originál dne 06.08.2007. Citováno 2008-07-14.
  5. ^ Ahn, Joomi; Bones, Jonathan; Yu, Ying Qing; Rudd, Pauline M .; Gilar, Martin (01.02.2010). "Separace 2-aminobenzamidem značených glykanů pomocí hydrofilní interakční chromatografické kolony naplněné 1,7 μm sorbentem". Journal of Chromatography B. 878 (3–4): 403–408. doi:10.1016 / j.jchromb.2009.12.013. PMID  20036624.
  6. ^ Glykosylační analýza hydrofilní interakční chromatografií (HILIC) - N-glykografické mapování ZP-domény myšího TGFR-3 (Aplikační poznámka TOSOH Biosciences). Citováno 23. května 2013.
  7. ^ Alpert, Andrew J. (leden 2008). „Elektrostatická odpuzující hydrofilní interakční chromatografie pro izokratickou separaci nabitých rozpuštěných látek a selektivní izolaci fosfopeptidů“. Anální. Chem. 80 (1): 62–76. doi:10.1021 / ac070997p. PMID  18027909.
  8. ^ Alpert, Andrew J .; et al. (Červen 2010). „Peptidová orientace ovlivňuje selektivitu v iontoměničové chromatografii“. Anální. Chem. 82 (12): 5253–5259. doi:10.1021 / ac100651k. PMC  2884984. PMID  20481592.
  9. ^ Ding, W .; et al. (Září 2009). „Identifikace a kvantifikace glykoproteinů pomocí iontového párování LC a MS v normální fázi“. Molekulární a buněčná proteomika. 8 (9): 2170–2185. doi:10,1074 / mcp.M900088-MCP200. PMC  2742440. PMID  19525481.